Upptäckten av en internationell grupp forskare, som inkluderar två brasilianer, kan bidra till att minimera föroreningar orsakade av materialet
En internationell grupp forskare, där två brasilianare från University of Campinas (Unicamp) deltar, lyckades förbättra prestanda för PETase, ett enzym som kan mata på polyetylentereftalat, PET-plast. Efter att PETase upptäcktes i en ny bakterieslag 2016 arbetade forskargruppen för att få enzymets struktur och förstå dess funktion. I denna process slutade de av misstag skapa en mutation av enzymet som har en ännu större affinitet med PET - det vill säga en större potential att bryta ner plast.
Arbetet har en enorm potential för praktisk användning, eftersom det uppskattas att mellan 4,8 och 12,7 miljoner ton plast lanseras varje år i haven - ett antal som bara tenderar att växa. Plast, som ackumuleras även på de mest avlägsna stränderna på planeten, används så exakt på grund av deras motståndskraft mot nedbrytning, vilket är det som hotar miljön mest. När den kastas kan en PET-flaska till exempel stanna kvar i miljön i 800 år - förutom det växande och alarmerande problemet med mikroplast.
- Förstå miljöpåverkan av plastavfall för livsmedelskedjan
- Vad är ursprunget till plasten som förorenar haven?
Med allt detta är det lätt att förstå det stora intresset som väcks av upptäckten av ett enzym som kan smälta polyetylentereftalat. Detta enzym, kallat PETase, har nu ökat sin förmåga att bryta ned plast. Nyheten beskrevs i en artikel publicerad i Proceedings of the National Academy of Sciences i Amerikas förenta stater (PNAS).
Två forskare från Chemistry Institute vid State University of Campinas (IQ-Unicamp) deltog i forskningen i samarbete med forskare från Storbritannien (University of Portsmouth) och USA (National Renewable Energy Laboratory). De är postdoktor Rodrigo Leandro Silveira och hans handledare, professor och prorektor för forskning vid Unicamp Munir Salomão Skaf.
”Polyetylentereftalat används huvudsakligen vid tillverkning av dryckesflaskor och används ofta vid tillverkning av kläder, mattor och andra föremål. I vår forskning karakteriserade vi den tredimensionella strukturen av enzymet som kan smälta denna plast, konstruerade den, öka dess nedbrytningsförmåga och visade att den också är aktiv i polyeten-2,5-furandikarboxylat (PEF), en ersättning för PET tillverkad av från förnybara råvaror, säger Silveira till Agência FAPESP.
Intresset för PETase uppstod 2016, när en grupp japanska forskare, ledd av Shosuke Yoshida, identifierade en ny bakterieslag, Ideonella sakaiensis , som kunde använda polyetylentereftalat som källa till kol och energi - med andra ord kapabelt att mata på PET. Det är fram till idag den enda kända organismen med denna kapacitet. Det växer bokstavligen på PET.
”Förutom att identifiera Ideonella sakaiensis upptäckte japanerna att de producerade två enzymer som utsöndras i miljön. Ett av de utsöndrade enzymerna var PETase. På grund av sin kristallinitetsgrad är PET en polymer som är mycket svår att bryta ned. Vi använder tekniskt begreppet "recalcitrance" för att namnge den egenskap som vissa högförpackade polymerer måste motstå nedbrytning. PET är en av dem. Men PETase attackerar och bryter ner det i små enheter - mono (2-hydroxietyl) tereftalsyra (MHET). MHET-enheterna omvandlas sedan till tereftalsyra [av ett andra enzym] och absorberas och metaboliseras av bakterierna ”, säger Silveira.
Alla kända levande saker använder biomolekyler för att överleva. Alla utom Ideonella sakaiensis, som lyckas använda en syntetisk molekyl, tillverkad av människor. Detta betyder att denna bakterie är resultatet av en mycket ny evolutionär process, som inträffade under de senaste decennierna. Det lyckades anpassa sig till en polymer som utvecklades i början av 1940-talet och först började användas i industriell skala på 1970-talet. Därför är PETase nyckeldelen.
”PETase gör det svåraste, det är att bryta den kristallina strukturen och avpolymerisera PET i MHET. Arbetet med det andra enzymet, som omvandlar MHET till tereftalsyra, är redan mycket enklare, eftersom dess substrat bildas av monomerer till vilka enzymet har enkel åtkomst eftersom de är dispergerade i reaktionsmediet. Därför fokuserade studierna på PETase ”, förklarade Silveira.
Nästa steg var att studera PETase i detalj och det var bidraget från den nya forskningen. ”Vårt fokus var att ta reda på vad som gav PETase förmågan att göra något som andra enzymer inte kunde göra mycket effektivt. För detta var det första steget att erhålla den tredimensionella strukturen för detta protein, sade han.
”Att erhålla den tredimensionella strukturen innebär att man upptäcker x-, y- och z-koordinaterna för var och en av de tusentals atomer som utgör makromolekylen. Våra brittiska kollegor gjorde detta arbete med en välkänd och använd teknik, kallad röntgendiffraktion, förklarade han.
Modifierat enzym binder bättre till polymeren
Efter att ha fått den tredimensionella strukturen började forskarna jämföra PETase med relaterade proteiner. Det mest liknar ett cutinas av bakterien Thermobifida fusca, som bryter ned cutin, en slags naturlig lack som täcker växternas löv. Vissa patogena mikroorganismer använder cutinaser för att bryta cutinbarriären och passa de näringsämnen som finns i bladen.
Bild: PETas-struktur, i blått, med en PET-kedja (i gult) ansluten till dess aktiva plats, där den kommer att brytas ned. Pressmeddelande / Rodrigo Leandro Silveira.
”Vi fann att i det område av enzymet där kemiska reaktioner förekommer, det så kallade” aktiva stället ”, visade PETase vissa skillnader i förhållande till kutinas. Den har en mer öppen aktiv webbplats. Genom datorsimuleringar - och det var den delen där jag bidrog mest - kunde vi studera enzymets molekylära rörelser. Medan den kristallografiska strukturen, erhållen genom röntgendiffraktion, ger statisk information, gör simuleringarna det möjligt att ha dynamisk information och att upptäcka varje aminosyras specifika roll i nedbrytningsprocessen för PET ”, förklarade forskaren från IQ-Unicamp.
Molekylens rörelsefysik beror på de elektrostatiska attraktionerna och avstötningarna från den enorma uppsättningen atomer och temperaturen. Datorsimuleringar gjorde det möjligt för oss att bättre förstå hur PETase binder och interagerar med PET.
”Vi fann att PETase och cutinase har två olika aminosyror på det aktiva stället. Genom molekylärbiologiska förfaranden producerade vi sedan mutationer i PETase, i syfte att omvandla det till kutinas ”, säger Silveira.
”Om vi kunde göra det skulle vi visa varför PETase är PETase, det vill säga vi skulle veta vilka komponenter som ger den den egendomliga egenskapen att förnedra PET. Men till vår förvåning producerar vi ett ännu mer aktivt PETas när vi försöker undertrycka PETases speciella aktivitet, det vill säga när vi försöker förvandla PETase till cutinase. Vi försökte minska aktiviteten och istället ökade vi den, sa han.
Detta krävde ytterligare beräkningsstudier för att förstå varför det mutanta PETaset var bättre än det ursprungliga PETaset. Med modellering och simuleringar var det möjligt att märka att de förändringar som produceras i PETase gynnar kopplingen av enzymet med substratet.
Det modifierade enzymet binder bättre till polymeren. Denna koppling beror på geometriska faktorer, det vill säga typen "nyckel och lås" passar mellan de två molekylerna. Men också av termodynamiska faktorer, det vill säga av interaktionerna mellan de olika komponenterna i enzymet och polymeren. Det eleganta sättet att beskriva detta är att säga att det modifierade PETaset har "större affinitet" för substratet.
När det gäller en framtida praktisk tillämpning, att erhålla en ingrediens som kan förnedra massor av plastavfall, var studien en stor framgång. Men frågan om vad som gör PETase till ett PETase förblir obesvarat.
”Cutinase har aminosyror a och b. PETase har aminosyrorna x och y. Vi föreställer oss att genom att byta x och y mot a och b skulle vi kunna förvandla PETase till ett cutinase. Istället producerar vi ett förbättrat PETase. Med andra ord är de två aminosyrorna inte förklaringen till de två enzymernas differentiella beteende. Det är något annat, säger Silveira.
Pågående utveckling
Cutinase är ett gammalt enzym, medan PETase är ett modernt enzym som härrör från det evolutionära trycket som gjorde det möjligt för Ideonella sakaiensis att anpassa sig till ett medium som endast eller huvudsakligen innehåller polyetylentereftalat som källa till kol och energi.
Bland de många bakterier som inte kan använda denna polymer har någon mutation genererat en art som har lyckats göra det. Denna bakterie började reproducera sig och växa mycket mer än de andra eftersom den hade tillräckligt med mat. Med det utvecklades det. Åtminstone är detta förklaringen från standard evolutionsteori.
”Det faktum att vi fick ett bättre enzym genom att göra en liten förändring tyder starkt på att denna utveckling ännu inte har fullbordats. Det finns fortfarande nya evolutionära möjligheter att förstå och utforska för att få ännu mer effektiva enzymer. Förbättrad PETase är inte slutet på vägen. Det är bara början, säger Silveira.
I syfte att applicera är nästa steg att flytta från laboratorium till industriell skala. För detta kommer ytterligare studier, relaterade till reaktorteknik, processoptimering och kostnadsminskning att krävas.
